四川中医药科学院： 基于高通量测序中江丹参“发汗”过程中优势微生物群落与主要药效成分相关性研究

  “发汗”是道地药材产区传统加工炮制技术之一，是产地初加工长期生产实践和经验积累的智慧结晶。即将新鲜药材稍加热或部分干燥后，堆积发热，使其内部水分向外蒸发，凝成水珠附于药材表面，如人体出汗，故称为“发汗”[1]。研究表明，“发汗”加工可使药材内部水分重新分布，加快干燥速度；促进药效成分的生物与化学转化；改善药材外观、质地、气味、药性等，进而影响药理作用等[2-5]。随着温、湿度变化，“发汗”过程中药材的微生物群落结构和多样性也发生明显的变化，进而改变药效成分及药理作用[6-10]。

  丹参为唇形科丹参属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功[11]。丹参“发汗”后，药材条直，表面呈暗红棕色，断面变紫，目前，中江丹参道地产区仍有沿用“发汗”加工法的传统，明代李时珍认为“丹参，其根皮丹而肉紫”[12]，而中江丹参经“发汗”处理断面多为棕褐色或紫褐色，通常被认为是质量上乘的性状指标[13-15]。目前，关于中药“发汗”过程中微生物群落结构特征及其对药效成分影响的相关研究较少。因此，本研究采用高通量扩增测序技术，探索“发汗”过程中江丹参药材的微生物群落特征及变化规律，并结合化学品质分析，深入探究优势微生物群落与中江丹参药效成分之间的相关性，旨在寻找影响中江丹参药材品质相关的优势微生物群落，为中江丹参“发汗”这一特色产地加工技术的科学内涵提供理论依据。

  Analytik Jena-q Tower 2.2 型荧光定量 PCR 仪，德国 Analytik Jena AG 公司； Agilent 1260 型高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司； Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ）； XS205 型电子分析天平，十万分之一，瑞士 Mettler Toledo 股份有限公司； KQ2200 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司； DHG-9240 型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司； BSA224S 型电子分析天平，万分之一，德国 Sartouris 股份有限公司； DFY-200 型摇摆式高速万能粉碎机，浙江温岭市林大机械有限公司；药典筛，四号筛， 0.25 μm 孔径，浙江上虞市道墟化验仪器设备厂；微孔滤膜， 0.45 μm 孔径，有机尼龙 66 ，天津市科亿隆实验设备有限公司； c-DNA 提取试剂盒，北京艾德莱生物科技有限公司。

  1.2.2 药材及加工处理 丹参样品于 2023 年 2 月采集于四川省德阳市中江县集凤镇小脚坡村（ E104°67′ ， N31°03′ ），选取同一农户、同一地块中江丹参植株若干，除去地上部分，取中江丹参地下根和根茎，趁鲜带回，经四川省中医药科学院李青苗研究员鉴定为唇形科丹参属植物丹参 S. miltiorrhiza Bge. 的根及根茎。通过混样将所有地下根和根茎平均分为 10 份，随机取其中 2 份，设置为实验空白样品，不作任何处理。

  本实验以丹参大部分根茎断面变棕褐或紫褐色，作为评定“发汗”结束的标准。模拟中江丹参种植农户的传统“发汗”方式，总计堆置“发汗”时长为 10 d 。设定“发汗”每满 5 d 取样 1 次，第 1 次取样后将样品敞开摊晾 2 d ，再次“发汗” 5 d ，完成第 2 次取样。样品共计 21 个，分别标记为 A （新鲜样品， 0 d ）、 B （第 1 次发汗 5 d ，各样品分别编号 B1 ～ B10 ）、 C （第 2 次发汗 5 d ，各样品分别编号 C1 ～ C10 ）。各样品取后立即存放在 −80 ℃ 低温冰箱中 冷冻，备用。样品信息见表 1 。

  中江丹参“发汗”过程中样品的真菌 ITS 区及细菌 V1 ～ V9 区基因测序，由成都丹凤科技有限公司完成。将所有待测样品在无菌条件下用液氮研磨仪研成细粉后，平均分为 3 份，用 c-DNA 提取试剂盒按照试剂盒的使用说明，提取 DNA[16-17] ，用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

  所有样品的 PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测，参照电泳初步定量结果，对目的条带使用索莱宝公司提供的凝胶回收试剂盒回收产物， PCR 产物用 Analyti Kjena-q TOWER 2.2 型荧光定量 PCR 仪进行仔细的检测定量。之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

  将测序结果在 LC-Bio 公司提供的 Illumina NovaSeq 平台上做多元化的分析。使用 Pear 合并读取配对端。根据 fqtrim （ v 0.94 ）获得高质量清洁标签的条件。筛选嵌合序列采用 Vsearch 软件（ v 2.3.4 ）。使用 DADA 2 进行去重复后，得到特征表和特征序列。进而选择所有的样品统一按最小样本序列数进行抽平分析，基于抽平后的数据，使用 QIIME 2 软件计算 α 多样性指数与 β 多样性指数分析，采用 R 软件（ v3.5.2 ）绘制分析图片，基于分类学信息，对各个分类水平上的群落结构可以进行统计分析。

  （1）水溶性成分： 取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 对照品，精密称定，加 75% 甲醇制成含丹参素钠 2.42 mg/mL 、迷迭香酸 0.53 mg/mL 、紫草酸 0.34 mg/mL 、丹酚酸 B 0.19 mg/mL 的混合对照品溶液，即得， 4 ℃下保存。

  （2）脂溶性成分： 取二氢丹参酮 I 、隐丹参酮、丹参酮 I 、丹参酮 II A 对照品，精密称定，加甲醇制成 含二氢丹参酮 I 0.83 mg/mL 、隐丹参酮 1.75 mg/mL 、丹参酮 I 1.24 mg/mL 、丹参酮 II A 2.48 mg/mL 的混合对照品溶液，即得， 4 ℃下保存。

  （1）水溶性成分： 取丹参粉末（过 4 号筛）约 0.25 g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 75% 甲醇 25 mL ，密塞，称定质量，超声处理（功率 140 W 、频率 42 kHz ） 40 min ，放冷，再称定质量，用 75% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，过 0.45 µm 微孔滤膜，即得水溶性成分供试品溶液。

  （2）脂溶性成分： 除溶剂为甲醇外，其他同“ 2.4.2 （ 1 ）”项。

  2.4.4 线性关系考察 精密吸取“ 2.4.1 ”项下对照品溶液 1 、 3 、 5 、 10 、 15 、 17 µL 进样分析，在“ 2.4.3 ”项色谱条件下测定，以对照品溶液含有量为横坐标（ X ），相对峰面积为纵坐标（ Y ）进行线性回归，得回归方程：丹参素钠 Y ＝ 46.275 X － 0.585 3 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；迷迭香酸 Y ＝ 682.740 X － 0.257 7 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；紫草酸 Y ＝ 4 718.20 X ＋ 149.85 ， r ＝ 0.999 9 ， 线 µg ；丹酚酸 B Y ＝ 12 421.0 X ＋ 215.69 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；二氢丹参酮 I Y ＝ 2 365.2 X ＋ 487.74 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；隐丹参酮 Y ＝ 2 424.4 X ＋ 2 542.2 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；丹参酮 I Y ＝ 6.031 8 X ＋ 7.171 3 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；丹参酮 II A Y ＝ 1 661.10 X ＋ 1 287.50 ， r ＝ 0.999 7 ，线 µg ；根据结果得出，各成 分在各自质量浓度范围内呈良好的线 高通量测序数据统计及 α 多样性统计 通过对中江丹参“发汗”过程中，不同取样时间点样品进行微生物群落结构和多样性测序分析质控后，线 条有效序列，平均每个样本具有 （ 80 835 ± 41 742 ）条。细菌共 78 666 条有效序列，平均每个样本具有（ 76 770 ± 7 490 ）条。每个样品的覆盖率均在 95% 以上，表明测序深度均已覆盖到测试样品中的大部分物种，具有可靠的数据质量。对于线 样品具有较高的 Shannon 均匀度指数（ 4.99 ），具有较高的 Chao l 指数（ 258.00 ），表明此时真菌群落多样性高；此时真菌物种也最为丰富，说明 9 号样品的发汗条件（室外光照空旷，黑色塑料薄膜覆盖，堆置高度 20 cm ）在发汗时间 5 d 时，真菌的物种总数和种类显著增加，这可能与此“发汗”条件创造的湿热环境适宜药材中内生真菌快速生长繁殖有关。且折线图显示 Chao l 指数估计发汗 10 d 的所有样品真菌群落丰度明显高于其他样品。结果见图 3 。

  由图 4 可知，Chaol 指数估计发汗5 d 的样品细菌丰度普遍较大，并明显高于0 、10 d 的样品，说明在“发汗”5 d 左右样本中细菌物种总量最高，群落组成最复杂；此外，8 号发汗条件（室外光照空旷，黑色塑料薄膜覆盖，堆置高度15 cm ）的样品Chao l 指数明显高于其他发汗条件样品。Shannon 均匀度指数显示8 号发汗条件的样品细菌多样性明显高于其他发汗条件样品，并在发汗5 d 时出现最大值（3.38 ），这可能是由于新鲜丹参室外覆膜堆置，加之黑色薄膜聚热较强，为药材表面适合高温生长的细菌创造了活动繁殖的条件。

  2.5.2 “发汗”过程中丹参样品微生物群落结构组成及变化规律 将不同“发汗”时间点的微生物根据总的测序结果进行筛选并计算，观察微生物在各时间点的变化趋势。采用 RDP classifier 对各样品中的 OTU 进行门及属水平的信息分析。

  “发汗”过程中丹参样品微生物门水平群落组成特征：根据高通量测序结果，从 21 份供试样本检测到 6 个真菌菌门，其中主要由子囊菌门 Ascomycota Banani, H. 、担子菌门 Basidiomycota Loftus, B. J. 组成，结果见图 5 。子囊菌门为中江丹参“发汗”过程中的非常大的优势线 d 时的丹参样本在 80% 左右，其他样品的质量分数均在 85% 以上，个别发汗条件接近 100% 。担子菌门在 5 号发汗条件，发汗 10 d 的丹参样品中含量最高，为 6.60% ，其次在 1 号发汗条件，发汗 10 d 时为 3.83% 。

  “发汗”过程中的丹参样品微生物属水平群落组成特征：中江丹参“发汗”过程中 21 个样本共检出 221 个真菌菌属，主要有小戴卫霉属 Davidiella Giroux, E. and Bilodeau, G 、轮枝菌属 Verticillium 、 赤霉菌属Gibberella Cuomo, C. A. 、富克葡萄孢盘菌属Botryotinia De Guido, M. A. 等。“发汗”初期与后期的优势真菌属差异较明显，在已知真菌中，以富克葡萄孢盘菌属相对丰度变化最大（2.098% ～14.454% ），结果见图7 。

  “发汗”初期（0 ～5 d ），通过群落组成分析发现主要以小戴卫霉属相对居多；发汗后期（5 ～10 d ），小戴卫霉属的相对丰度降低，样本丰度较大的真菌 菌属变为轮枝菌属。丹参“发汗”过程检出 677 个细菌菌属，已知细菌最重要的包含节杆菌属 Arthrobacter 、链霉菌属 Streptomyces Ohnishi, Y. 、根瘤菌属 Allorhizobium Gan, H. M. 等。“发汗”过程中（ 0 ～ 10 d ）样本丰度较高的主要是一些无法归类和其他菌属，结果见图 8 ，主要为绿菌门未归类菌属 Chloroplast _unclassified 和根瘤菌属未归类菌属 Mitochondria _unclassified ，二者在该过程中呈波动变化，其中绿菌门未归类菌属质量分数较高（在 60% 以上）且有逐步增加的趋势；在已知细菌中，以节杆菌属相对丰度变化较大（ 1.73% ～ 4.04% ）。

  2.5.3 “发汗”过程中的丹参样品微生物属水平相对丰度分布 选取丰度排名为前 30 的真菌属，根据每个样本各属的丰度均值，分别对样本之间真菌相对丰度进行聚类分析，得到 Heatmap 热图。中江丹参“发汗”过程中所有线 的菌属与“发汗”过程的 21 个样本之间的相互关系，结果见图 9 。在前 10 的菌属中，分类不明确的线 个。已知真菌属中，小戴卫霉属和轮枝菌属距离比较接近，归属同一分支，两者在所有丹参“发汗”样本中含量均较大，为丹参“发汗”过程中的优势菌属，推测这 2 个真菌菌属在“发汗”过程中可能参与引起丹参药材质量的改变，或者为丹参药材表面“霉菌”的主要菌群。赤霉菌属和子囊菌门未归类霉属 Ascomycota _unclassified 也属于同一分支，并且均在 1 ～ 10 d 样本中含量较大，在“发汗”中后期（ 5 ～ 10 d ）含量有所降低，在初期（ 1 ～ 5 d ）的样本中含量相比来说较高，推测二者也可能是参与中江丹参“发汗”引起其药材性状、化学成分等改变的主要菌属。

  丹参“发汗”过程中样本在属水平上的细菌群落 Heatmap 图，结果见图 10 。已知的 7 个细菌属中，节杆菌属和链霉菌属存在于各个样本中，“发汗”过程中（ 1 ～ 10 d ）丰度均相比来说较高。而黄杆菌属 Flavobacterium 和埃希氏杆菌属 Escherichia 在“发汗”中后期（ 5 ～ 10 d ）含量极低，推测二者并非是丹参“发汗”引起药材性状、化学成分改变的主要菌属。

  2.5.4 中江丹参“发汗”过程中微生物相对丰度值（属水平上）与其 8 种主要药效成分含量的相关性研究 使用 SPSS 软件做相关性分析，选取丹参样品中 8 种药效成分（丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 、二氢丹参酮 I 、隐丹参酮、丹参酮 I 、丹参酮 II A ）的含量与样品中微生物（线 的相对丰度值（属水平上）相关联，以期进一步判定“发汗”过程中对丹参药材品质产生影响的优势微生物群落，结果见表 2 ～ 4 。

  结果可见，“发汗”丹参样品属水平上优势线 小戴卫霉属与样品中紫草酸含量呈现显著的 负相关关系，相关系数为 0.353 。其次，优势线 子囊菌门未归类霉属与丹参酮 II A 的含量呈现显著的正相关关系，相关系数为 0.320 。表明，小戴卫霉属相对丰度越高，紫草酸的含量越低。子囊菌门未归类霉属相对丰度越高，丹参酮 II A 的含量越高。

  结果可见，“发汗”丹参样品属水平上优势细菌 TOP 1 绿菌门未归类菌属与样品中迷迭香酸、水溶性成分含量呈显著的正相关关系，相关系数分别为 0.330 、 0.379 ；与丹酚酸 B 含量呈极显著的正相关关系，相关系数为 0.434 ；与丹参酮 I 含量呈显著的负相关关系，相关系数为 0.392 。其次，优势细菌 TOP 5 根瘤菌属菌群 Allorhizobium -Neorhizobium- Pararhizobium-Rhizobium 与紫草酸的含量呈显著的正相关关系，相关系数为 0.461 。表明绿菌门未归类相对丰度越高，迷迭香酸、丹酚酸 B 、水溶性成分的含量越高，丹参酮 I 含量越低。根瘤菌属菌群 Allorhizobium -Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 相对丰度越高，紫草酸的含量越高。

  人类认识微生物群落的参与协同作用古已有之，并延续至今。如食品发酵、酿酒酿造、中药炮制等 [19-23] ，现代学者将微生物资源与中药品质相结合，发现其具有变色、提质、减毒、增效等作用。如杨放晴等 [24] 发现陈皮表面的曲霉属 Aspergillus 是 引起黄酮类和挥发油含量与类型变化的主要的因素。陈聪聪 [25] 研究之后发现，陈皮表面芽孢杆菌属 Bacillus 、乳酸链球菌属 Lactococcus 、假单胞菌属 Pseudomonas 等优势细菌可加速其挥发油的生物转化。杨丹等 [26]

  研究发现，黑曲霉对不同陈化年份广陈皮的黄酮类成分均有一定影响，其中，陈化 2 年广陈皮影响最大，总黄酮、橙皮苷和川陈皮素含量均有增加。魏担等 [6] 发现“发汗”后厚朴的“气味浓厚，内表面变为棕褐色”这一性状特征的形成可能与曲霉属和假丝酵母菌属 Candida 等微生物群落代谢有关。吴晓峰 [27] 通过 2 种真菌（灵芝菌与白僵菌）对中药巴豆进行发酵，发现发酵品的毒性成分含量明显降低，其组成成分也发生了较大变化；表明发酵对巴豆具有“去毒存效”的作用。陈丽艳等 [28] 通过实验发现 黄芩经侧耳菌和黑曲霉发酵后，苷类成分被转化为苷元或其他物质，有利于提高黄芩的生物利用度及药理活性。

  传统“发汗”加工为药材产地初加工长期生产实践和经验积累形成的独具特色的产物，该法可促使药材内部水分重新分布，加快干燥速度，同时改变化学成分，赋予药材独特的品质特征与临床疗效。作为著名川产道地药材，中江丹参由于多在冬春交替时采收，雨水较多，至今“发汗”法仍在当地农民中沿用，目前尚无关于中江丹参“发汗”过程主要微生物群落的相关研究，本课题组通过对中江丹参道地产区的实地调研，模拟当地“发汗”条件及环境，运用高通量测序技术方法，结合化学品质分析，发现中江丹参在“发汗”过程中始终存在的主要已知优势真菌有小戴卫霉属、轮枝菌属、赤霉菌属、富克葡萄孢盘菌属；主要优势细菌有绿菌门未归类菌属和根瘤菌属未归类菌属的 2 个菌属，已知优势细菌有节细菌属、链霉菌属、根瘤菌属等。其中，小戴卫霉属真菌多存在于发酵酿造样品中，如食醋、酱油等，且随着发酵时间有增高的趋势 [29] ；轮枝菌属真菌是一种分布广、适应能力强且常见的真菌，是农业上引起作物黄萎的重要病原菌 [30] ；赤霉菌属真菌分泌赤霉素，可促进植株快速生长，有结实率降低、减产等危害；绿菌门细菌多存在于无氧环境，为不产氧光合作用的显绿色细菌；根瘤菌属细菌从植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，与植物共生固氮，对植物生长有良好作用。《中国药典》 2020 年版丹参项下含量测定中的指标成分包括脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮 I 、丹参酮 II A ，水溶性成分丹酚酸 B ；考虑到中药药效成分的复杂性，及“发汗”过程中温湿度变化对化学成分的影响 [13,31-33] ，因此增加了“发汗”丹参化学成分中水溶性成分丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸作为测定指标，以期明确微生物群落对药效成分类型的影响。从“发汗”样品属水平上微生物群落丰度与主要药效成分的相关性根据结果得出，优势真菌小戴卫霉属与发汗样品中紫草酸含量呈现显著的负相关关系；子囊菌门未归类霉属与丹参酮 II A 含量呈现显著的正相关关系。

  优势细菌绿菌门未归类菌属与发汗样品中迷迭香酸、水溶性成分含量呈现显著的正相关关系，相关系数分别为 0.330 、 0.379 ；与丹酚酸 B 含量呈现极显著的正相关关系，相关系数为 0.434 ；与丹参酮 I 含量呈现显著的负相关关系，相关系数为 0.392 。根瘤菌属菌群 Allorhizobium -Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 与紫草酸含量呈现显著的正相关关系。

  综上所述，本研究初步揭示了中江丹参“发汗”过程中存在的主要微生物群落及变化规律，证明了优势微生物群落与“发汗”丹参的优良品质存在一定相关性。由于不同加工地点、加工环境及当地气候均会影响丹参中的微生物种群，后续需对本研究结果进行重复或地点变更的验证实验，同时进一步对优势微生物进行分离筛选，探究发汗“发霉”后霉菌对中江丹参药材品质的影响。

  来 源：王晓宇，张松林，王 颖，郭俊霞，吴 萍，李青苗．基于高通量测序中江丹参“发汗”过程中优势微生物群落与主要药效成分相关性研究 [J]. 中草药, 2024, 55(2): 420-433.